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重组蛋白表达和纯化分析

发布时间 2018-01-19
 

如果你打算将目的蛋白应用于下游实验,那么成功表达重组蛋白是很重要的。如果一开始,你花点时间优化蛋白的可溶性,将会大大节约你后续纯化的时间。关于重组蛋白表达和纯化,可参考如下建议:

标签中有什么?

选择“正确”标签可能是一项艰巨的任务。理想的标签将帮助你获得可溶性蛋白,简化你的纯化方案,并且不会干扰下游应用。然而,考虑到载体可用的切割位点过多,你唯一的担心应该是哪个标签将有助于目标蛋白的溶解、表达和纯化—标签总是可以切除的,如果你担心它会干扰目标蛋白的行为。

某些标签,例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或麦芽糖结合蛋白(MBP)被认为可增加蛋白的溶解性。这些标签的缺点是它们的大小—GST约26kDa,MBP为41kDa。 其他标签(六聚组氨酸,FLAG,链霉亲和素)相对较小,通常选择它们以便于捕获和纯化。 选择几个不同的标签,然后克隆!如果可能的话,使用C端标签,这意味着你纯化的任何蛋白将是全长,没有任何截断。

获得可溶性蛋白

重组蛋白表达的常见问题是真核蛋白在细菌中表达时倾向于不溶。变性,聚集和/或截短形式的蛋白形成不可溶的包涵体,需要进一步纯化和重折叠,这可能是低效的和不完全的。

以下是获得可溶性天然蛋白质的三个关键参数:

IPTG浓度

有可能,宿主中的蛋白表达将通过lac操纵子系统操作。这个系统的详细解释可以在别处找到,你加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),一种乳糖类似物,控制蛋白的表达。蛋白的表达应处于生长的对数期,即当溶液的波长600(OD 600)处的光密度达到0.4-0.6。 如果你的目标是可溶性蛋白质,最好不要改变细胞中蛋白的折叠功能。已经假定不溶性蛋白可能是由于分子伴侣的存在。因此,使用高浓度的IPTG(> 1mM)可能不总是产生最好的结果。尝试几个不同的浓度,看看哪一个给你最高的可溶性蛋白的产量。

温度

偶尔,你可以在37°C的典型温度下,通过生长和诱导分离可溶性形式的蛋白质,但通常情况下,溶解度在较低温度下增强。可尝试在30°C,25°C和18°C下进行诱导。 注意:如果首先在37℃生长,先让培养物冷却到诱导温度,再加入IPTG。

诱导时间

更长并不总是更好。对于对宿主有毒的蛋白尤其如此。在诱导期间,每隔几个小时取样,并检查目的蛋白的表达。典型的诱导时间根据温度而变化:对于37℃,尝试4小时;对于30℃,进行5-6小时,并且任何低于25℃的温度应该允许生长过夜。

预实验

将目的蛋白的编码序列克隆到具有不同标记(例如六组氨酸,谷胱甘肽-S-转移酶(GST),麦芽糖结合蛋白(MBP))的2-3个载体中。然后选择三种不同的诱导时间和温度以及几种IPTG浓度。进行小规模预实验。诱导后,分析每个样本中的(1)未诱导样本;(2)在不同时间点的诱导样本;(3)裂解物;(4)可溶性片段。

将目的蛋白的编码序列克隆到具有不同标记(例如六组氨酸,谷胱甘肽-S-转移酶(GST),麦芽糖结合蛋白(MBP))的2-3个载体中。然后选择三种不同的诱导时间和温度以及几种IPTG浓度。进行小规模预实验。诱导后,分析每个样本中的(1)未诱导样本;(2)在不同时间点的诱导样本;(3)裂解物;(4)可溶性片段。

以上建议都没有达到预期的效果?

虽然遵循了上面的建议,你可能会发现,你仍然无法获得可溶性蛋白,或许可以尝试如下解决方案:

只表达目标蛋白的一部分:较小的结构域通常是可溶的,即使全长蛋白不是;

使用不同的表达系统:这甚至可能保留目标蛋白的翻译后修饰;

在变性条件下纯化:虽然不总是最好的方法,在变性条件下(即在高浓度的胍或尿素的离液盐中)纯化有时是唯一的解决方案。通常这些条件可以给你一个更纯的样品,因为可溶性污染蛋白被移除。唯一的问题是重折叠;然而,有许多方案可用于包涵体蛋白的重折叠。

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